在实验之前经常必需侦测细胞内的衰老可能，这里概述了几种罕见的衰老侦测方律，希望能够帮到你。
一细胞内衰老的亲缘侦测
时有发生衰老的细胞内在共通点上有一定的相似性。
光学孔径和倒置孔径
仍未漂白细胞内：衰老细胞内的纤积变小、变形，细胞内悬浮取值得肯定但显现出凝胶现象，细胞内衰老中期可见衰老小纤。贴壁细胞内显现出皱缩、变圆、脱落。
漂白细胞内：近似于姬姆萨漂白、瑞氏漂白等。衰老细胞内的漂白质一表征、停滞不前，质子悬浮降解、漂白质拆分转成块状和衰老小纤等取值得肯定的衰老共通点。
电子孔径孔径和共看做激光扫描孔径
一般以细胞内质子漂白质的亲缘相反为指标来评审细胞内衰老的进展可能。
近似于的 DNA 专一性树脂有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种树脂与 DNA 的建构都是非嵌入式的，主要建构在 DNA 的 A-T 碱基区。紫另有光感受到时试射亮的蓝色电子孔径。
Hoechst 是与 DNA 特异建构的活性树脂，储存滴用硫酸混和 1 mg/ml 的电导率，应用于时用 PBS 混合物，终因电导率为 10 μg/ml。
DAPI 为半通透性，用以常规单独细胞内的漂白。储存滴用硫酸混和 1 mg/ml 的电导率，应用于终因电导率一般为 10 μg/ml。
结果评审
细胞内衰老每一次之前细胞内质子漂白质的亲缘相反包不下有三期：Ⅰ 期的细胞内质子呈棱角状（rippled）或呈折缝样（creased），其余部分漂白质显现出一表征状态；Ⅱa 期细胞内质子的漂白质极低度凝聚、停滞不前；Ⅱb 期的细胞内质子降解为碎块，诱发衰老小纤（由此可知 1）。
透射电子孔径肯定到
结果评审
衰老细胞内纤积变小，细胞内质一表征。衰老Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞内质子内漂白质极低度盘绕，显现出许多被称作气穴现象（citations）的空泡结构设不下；Ⅱa 期细胞内质子的漂白质极低度凝聚、停滞不前；细胞内衰老的中期，细胞内质子降解为碎块，诱发衰老小纤（由此可知 2）。
二Annexin V 律
脂类酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）长时间段座落细胞内悬浮的内侧，但在细胞内衰老的中期，PS 可从细胞内悬浮的内侧翻转到细胞内悬浮的表面，沾染在细胞内另有生态环境之前（由此可知 3）。Annexin-V 是一种聚合度为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性脂类建构肽，能与 PS 极低亲和力专一性建构。将 Annexin-V 同步进行电子孔径素（FITC、PE）或 biotin 标有，以标有了的 Annexin-V 作为电子孔径探针，利用流式细胞内星象或电子孔径孔径可侦测细胞内衰老的时有发生。
碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一种质子糖树脂，它很难借此取值得肯定的细胞内悬浮，但在衰老之前中期的细胞内和惨死细胞内，PI 能够借此细胞内悬浮而使细胞内质子红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配应用于，就可以将衰老早中期的细胞内以及惨死细胞内区隔开来。
方律
悬浮细胞内的漂白：将长时间段培养出来和展现出作用以衰老的悬浮细胞内（0.5～1×106）用 PBS 浸 2 次，沙入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标有的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，熔点避光 30 min，再次沙入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光催化 5 min 后，沙入 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 同步进行流式细胞内拳律表征侦测（一般不最多 1 h）， 同时以不沙 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性对照。
贴壁培养出来的细胞内漂白：先用 0.25% 的胰酶消化，净化、漂白和统不下分析同悬浮细胞内。
爬片细胞内漂白：同上，先前用电子孔径孔径和共看做激光扫描孔径同步进行肯定到。
结果
肯定事项
1. 整个可用跳跃要适度轻柔，切勿用力吹打细胞内。
2. 可用时肯定避光，催化完毕后尽速在一足足内侦测。
三线粒纤悬浮势能的侦测
线粒纤在细胞内衰老的每一次之前起着枢纽展现出作用，多种细胞内衰老激发因子均可展现出作用以相异的细胞内时有发生衰老，而线粒纤包涵悬浮电位（Δψm）的下降，被看来是细胞内衰老级联催化每一次之前最早时有发生的流血事件，它时有发生在细胞内质子衰老相似性（漂白质一表征、DNA 挤压）显现出之前，一旦线粒纤包涵悬浮电位崩溃，则细胞内衰老不可逆转。
线粒纤包涵悬浮电位的存在，使一些胺基酸金属离子电子孔径树脂如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可建构到线粒纤基质，其电子孔径的增强或西移动说明线粒纤内悬浮正离子的增极低或减小。
方律
将长时间段培养出来的细胞内和展现出作用以衰老的细胞内沙入应用于终因电导率为 Rhodamine 123（1 mM）或终因电导率为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 有利于 30 min，流式细胞内不下侦测细胞内的电子孔径其之前心。
肯定事项
1. 始终因保持有利于染滴之前 pH 取值的一致性，因为 pH 取值的转变将影响悬浮电位。
2. 与树脂达到有利于的细胞内悬滴之前如果不下有有肽，他们将与其余部分树脂建构，减小树脂的电导率，惹来假去极化。
四DNA 图片化侦测
细胞内衰老时主要的药剂相似性是其漂白质时有发生一表征，漂白质 DNA 在质子小纤单位之间的连接处挤压，构转成 50～300 kbp 长的 DNA 大图片，或 180～200 bp 整有数倍的寡质子苷酸图片，在悬浮电泳上表现为四边形电泳由此可知谱（DNA ladder）。
细胞内经处理后，运用以常规方律分立提纯 DNA，同步进行琼脂糖悬浮电泳和溴化乙啶漂白，在衰老细胞内群之前可肯定到到取值得肯定的 DNA ladder。如果细胞内量很少，还可在分立提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧质子糖质子苷酸尾端激酶（TdT）标有 DNA，然后同步进行电泳和放射自光学星象器机，肯定到衰老细胞内之前 DNA ladder 的构转成。
大化学键漂白纤 DNA 图片的测
细胞内衰老的中期，漂白纤挤压转被选为 50～300 kbp 长的 DNA 大图片。所有最多一定聚合度个数的双链 DNA 化学键在琼脂糖悬浮之前的迁移速度快相同。线性 DNA 的双螺旋半径最多悬浮半径时，即达到分辨力的极限。此时悬浮取而代之按聚合度的个数来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端朝向电场一极而通过悬浮，这种迁移模式称作「爬行」。因此，细胞内衰老中期诱发的 50～300 kbp 长的 DNA 大图片很难用普通的琼脂糖悬浮电泳来分立。
不一定运用以振荡器电泳技拳律可圆满地应对这一关键问题。这个方律是在悬浮上另有沙对偶的交变振荡器电场。每当电场方向相反后，大的 DNA 化学键便滞留在爬行管之前，直至一新电场轴向再次一定向后，才能继续向前移动。DNA 聚合度越大，这种重排所必需的时间段就越长。当 DNA 化学键变换方向的时间段多于电振荡器周期性时，DNA 就可以按其聚合度个数隔开。
DNA Ladder 测
方律
取得转成功细胞内（1×107）结晶→细胞内降解滴→13 000 rpm ×5 min→收集上清，沙 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，幼鸟 2 h→肽酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 纤积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍纤积的的水无水乙醇结晶 DNA，4 °C 留宿→14 000 rpm×15 min→先前将结晶硫酸在 TE buffer 之前，沙 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖悬浮电泳，EB 漂白并光学星象器。
结果
衰老细胞内 DNA 不下有量的流式细胞内不下统不下分析
方律
收集细胞内→70% 的水乙醇（PBS 混合物）4 °C 单独留宿→PBS 净化，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化 30 min→PI（50 mg/ml）漂白，熔点避光 15 min→FACScan 统不下分析 DNA 亚二倍纤的构转成及细胞内周期性的转变。
结果
ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay
优点：敏感度极低，适合于侦测少量样本，小其余部分衰老细胞内。如临床活组织侦测。
五TUNEL 律
细胞内衰老之前，漂白纤 DNA 双链挤压或单链挤压而诱发大量的粘性 3'-OH 尾端，可在脱氧质子糖质子苷酸尾端激酶（TdT）的展现出作用下，将脱氧质子糖质子苷酸和电子孔径素、催化反应酶、碱性磷酸酶或谷氨酸构转成的苯基标有到 DNA 的 3'-尾端，从而可同步进行衰老细胞内的侦测，这类方律被称作脱氧质子糖质子苷酸尾端激酶介导的后方尾端标有律（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。
由于长时间段的或正在转化的细胞内几乎并未 DNA 的挤压，因而并未 3'-OH 构转成，很少能够被漂白。TUNEL 实际上是化学键生物学与亲缘相建构的研究方律，对取值得肯定的单个衰老细胞内质子或衰老小纤同步进行原处漂白，能准确地催化细胞内衰老取值得肯定的生理学和共通点相似性，可用以石蜡包埋组织切口、冰冻组织切口、培养出来的细胞内和从组织之前分立的细胞内的细胞内共通点测，并可侦测出极少量的衰老细胞内，因而在细胞内衰老的研究之前被广泛运用以。
六Caspase-3 活性的侦测
Caspase 家族在介导细胞内衰老的每一次之前起着非常重要的展现出作用，其之前 Caspase-3 为关键的执行化学键，它在衰老接收器传导的许多途径之前展现出系统。Caspase-3 长时间段以酶原（32 KD）的方式存在于细胞质之前，在衰老的中期收尾，它被酪氨酸，转化的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组合而转成，降解其所的细胞质胞质子质子化，最终因导致细胞内衰老。但在细胞内衰老的中期和惨死亡细胞内，Caspase-3 的活性明显下降。
Western blot
统不下分析 Procaspase-3 的转化，以及转化的 Caspase-3 及对质子化多聚（ADP-质子糖）PCR（PARP）等的降解。
方律
收集细胞内→PBS 净化→抽提细胞内降解滴→肽表征→SDS-PAGE 电泳→水溶性悬浮或 PVDF 悬浮转移→5% 脱脂清空，熔点 1.5～2 h 或 4 °C 留宿→Caspase-3 多抗或单抗熔点催化 1～2 h 或 4 °C 留宿→TBS-T（不下有 0.05% Tween 20 的 TBS）浸 3 次，5～10 min/次→HRP-标有的驼抗鼠 IgG 或 AP 标有的驼抗鼠 IgG 熔点催化 1～2 h→ TBS-T 浸 3 次， 5～10 min/次→ECL 光学星象器机或 NBT/BCIP 显色。
结果
电子孔径分光光学设备统不下分析
转化的 Caspase-3 能够特异切割 D1E2V3D4-X 质子化，裂解 D4-X 羧酸。根据这一特点，设不下出电子孔径气态酪氨酸的更长肽 Ac-DEVD-AMC。在共价酪氨酸时，AMC 很难被感受到电子孔径，更长肽被裂解后积聚 AMC，受限制的 AMC 才能被感受到试射电子孔径。根据释放的 AMC 电子孔径其之前心的个数，可以测 Caspase-3 的活性，从而说明了 Caspase-3 被转化的以往。
方律
取得转成功细胞内长时间段或衰老细胞内→PBS 净化→制备细胞内降解滴→沙 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 电子孔径质子化）→37 °C 催化 1 h→电子孔径分光光学设备（Polarstar）统不下分析电子孔径其之前心（感受到光波长 380 nm，试射光波长为 430～460 nm）。
结果
流式细胞内拳律统不下分析
方律
取得转成功细胞内长时间段或衰老细胞内→PBS 净化→沙 Ac-DEVD-AMC→37 °C 催化 1 h→UV 流式细胞内不下统不下分析 Caspase-3 阳性细胞留有数和平均电子孔径其之前心。
结果
七TFAR19 肽表述和细胞内出发点统不下分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在欧美国家首先新闻媒体的一个享有自己智慧财产的人类新遗传，始自的系统研究表明，它是促进细胞内衰老的增强剂。利用电子孔径素（FITC）标有的 TFAR19 单克隆抗纤为探针，对细胞内衰老每一次之前 TFAR19 肽的表述以往及出发点研究发现，衰老中期 TFAR19 表述以往增极低并显现出快速质子可有现象，预示着细胞内质子亲缘的转变，接下来较长时间段，在衰老小纤之前仍然可见。
同时我们发现，衰老中期 TFAR19 肽的质子可有早于脂类酰丝氨酸（PS）另有翻和细胞内质子 DNA 的图片化，提示 TFAR19 肽的质子可有是细胞内衰老更中期时有发生的流血事件之一。全面的研究证明，衰老中期 TFAR19 的质子可有具普遍意义，相异细胞内衰老中期均显现出 TFAR19 极低表述和质子可有。这为研究细胞内衰老中期所时有发生的流血事件，提供了一种一新技拳律和指标。
TFAR19 肽的细胞内出发点统不下分析
材料氢化
FITC 标有的单克隆抗纤，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 不下有 0.2% Tween 20），胎牛肝细胞，电子孔径细胞内浸滴（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 不下有 2% 胎牛肝细胞及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移滴器。
星象器
低温以往离心机，37 °C 水浴箱，电子孔径孔径，共看做激光扫描孔径，流式细胞内星象。
方律
1. 悬浮细胞内的漂白
（1）取得转成功长时间段和展现出作用以衰老的细胞内（0.5～1×106），PBS 浸 2 次，1 000 rpm×10 min。
（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 浸 2 次，1 000 rpm×10 min。
（3）沙入 PBS-T 溶滴，37 °C 幼鸟 15 min，PBS 浸 2 次，1 000 rpm×10 min。
（4）沙入 200 ml 胎牛肝细胞，熔点催化 30 min。
（5）沙入 5 ml FITC 标有的 TFAR19 单抗（终因电导率为 1:40），4 °C 催化 30 min。
（6）电子孔径细胞内浸滴浸 2 次，1 000 rpm×10 min。
将细胞内结晶滴片，电子孔径孔径及共看做激光孔径下肯定到 TFAR19 在细胞内之前的出发点。同时用流式细胞内星象表征侦测 TFAR19 肽的平均电子孔径其之前心。
2. 贴壁细胞内的原处漂白
（1）贴壁生长的对有数期细胞内铺在 24 孔或 6 孔板之前（留有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到 50%～80 % 满时，衰老展现出作用以剂处理细胞内。
（2）将相异时间段点处理的细胞内同步进行免疫电子孔径漂白，漂白方法有同上。
（3）将漂白的爬片细胞内放于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，电子孔径孔径或共看做激光扫描孔径肯定到 TFAR19 在细胞内之前的出发点。
3. 临床病理切口的漂白、侦测
4. 原代细胞内的培养出来、侦测
5. 统不下分析 TFAR19 肽在人纤内各组织器官的产自及出发点
TFAR19 肽的表述与临床病症
ELISA 律侦测长时间段人和病症状态下，以及病症的相异时期，肝细胞之前 TFAR19 肽以往及其 TFAR19 自身抗纤以往。
材料和氢化
1. 都从 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 硫化物 Buffer
2. 净化滴： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 不下有 0.05% Tween 20
3. 清空滴： 3% BSA（用净化滴配制）
4. 酶标抗纤的混合物：用清空滴混合物
5. OPD 质子化 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，甘油 0.51 g，DDW 100 ml
6. 显色滴（现配现用）：质子化 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml
7. 终因止滴 2 mol/L H2SO4
8. 私营化人 TFAR19，HRP 标有的驼抗人 IgG9 ELISA 板，Tip，移滴器，ELISA Reader（OD 490 nm），浸板机
可用方法有
1. 用都从 Buffer 混合物的私营化人 TFAR19（1 mg/ml）都从 ELISA 板，100 ml/well，37 °C 幼鸟 2 h 或 4 °C 留宿（一般 24 h 以上）。
2. 净化 Buffer 浸板三次，沙入清空滴，200 ml/well ， 37 °C 幼鸟 2 h 或 4 °C 留宿。
3. 净化 Buffer 浸板三次，沙入相异混合物度的医护人员肝细胞（3 个以此类推孔）100 ml/well ，37 °C 幼鸟 1 h。设都从 Buffer、净化 Buffer 、清空滴为阴性对照。
4. 净化 Buffer 浸板三次，沙入 1:2 500 混合物的 HRP 标有的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 幼鸟 1 h。
5. 净化 Buffer 浸板三次，沙入显色滴，100 ml/well，避光催化 10～15 min。
6. 沙入 H2SO4 终因止催化，50 ml/well。
7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度取值，统不下分析和比较医护人员肝细胞和长时间段血 清之前 TFAR19 自身抗纤的表述以往。
8. Western blot 统不下分析原发性细胞内和长时间段细胞内的 TFAR 19 肽的表述以往。
注释
Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
文章来源：蒲公英园站友 midas
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编辑： 任悠悠相关新闻
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